Перенос Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens в эмбрионы морских ежей

Агробактерии — это почвенные растительные патогены, способные генетически изменять (трансформировать) биохимические процессы клеток высших растений, в результате чего последние начинают быстро расти (превращаются в опухолевые) и синтезировать опины. Опины агробактерии используют в качестве источников азота, углерода и энергии. Процессы агробактериальной трансформации, сопровождающиеся переносом генов от агробактерий к растениям, универсальны, потому что стало известно, что агробактерии способны также трансформировать клетки водорослей, грибов и млекопитающих.

Возник вопрос о возможности переноса генетической информации от агробактерий к другим группам живых существ, особенно к морским беспозвоночным, потому что до сих пор не известна причина появления у моллюсков и морских ежей генетических последовательностей, близким к генам агробактерий. Например, ген октопин дегидрогеназы характерен только для агробактерий и клеток морских беспозвоночных, схожих последовательностей у близкородственных групп морских животных нет. Возникли предположения об агробактериальной трансформации клеток моллюсков и морских ежей на их раннем этапе филогенетического развития, но эти предположения остались без экспериментального доказательства. Поэтому интересно: экспериментально доказать возможность переноса генов от агробактерий к морским беспозвоночным.

Для данного эксперимента использовали агробактерии A. tumefaciens, содержащие плазмиды с растительными онкогенами rolC и rolB (Рис.1) и эмбрионы морских ежей (Scaphechinus mirabilis, Strongylocentrotus nudus, St. intermedius).

Рис. 1. Плазмидные конструкции, используемые в эксперименте:

плазмида pPCV002-35S rolB, несущая функциональный ген rolB;

плазмида pPCV002-35S rolC, несущая функциональный ген rolС; NPTII — ген устойчивости к неомициновому ряду антибиотиков;

ori — сайт начала репликации;

pNOS — промотор нопалин синтазного гена агробактерий; NOS term-терминатор нопалин синтазного гена; 35S — промотор вируса CAMV.(Cauliflower mosaic virus); pAocs — терминатор гена октопинового синтаза.

Уже через 15-17 часов культивирования эмбрионов морских ежей с агробактериями мы наблюдали первые признаки генетической трансформации: эмбриональное развитие замедлялось, а на поверхности некоторых эмбрионов образовывались скопления клеток в виде опухолеподобных структур (ОПС) (Рис.2, Б).

Рис. 2. Эмбрионы плоского морскoго ежа: 24 часа культивирования. A — Контрольный эмбрион плоского морскoго ежа. Поздняя гаструла. Б — Эмбрион плоского морского ежа, обработанный агробактериями: 24 часа культивирования. Поздняя гаструла. Идет образование ОПС. Линейка 25 мкм.

Число эмбрионов с ОПС достигало 15% при трансформации эмбрионов плоского морского ежа (Sc. mirabilis) агробактериями, несущими ген rolB. При трансформации эмбрионов серого морского ежа число аномальноразвивающихся эмбрионов достигало 5-6% (ген rolB).

Рис.3. Количество эмбрионов с ОПС плоского (А) и серого (Б) морского ежа после обработки агробактериями после 17 часов развития:

К — контрольные эмбрионы,

Vector — эмбрионы, культивируемые в присутствии агробактерий, несущих вектор,

RolC — эмбрионы, культивируемые в присутствии агробактерий, несущих ген rolC,

RolB — эмбрионы, культивируемые в присутствии агробактерий, несущих ген rolB

Трансформировали агробактериями и плазмидной ДНК также и первичные клеточные культуры, полученные со стадии бластулы. Обработка клеточных культур морских ежей вызывала прирост числа клеток в культуре, в сравнении с контрольными клетками (Рис.4).

Рис. 4. Рост первичных клеточных культур, полученных со стадии бластулы S. mirabilis. A — Эмбриональные клетки плоского морского ежа, не обработанные плазмидами: 16 день культивирования. Б — Эмбриональные клетки плоского морского ежа, обработанные плазмидой rolB: 16 день культивирования. Видны окрашенные клетки.

Возможно, полученные результаты можно объяснить успешной встройкой онкогенов агробактерий на начальном эмбриональном развитии морских ежей, что приводит к нарушению развития и процессов деления клеток.

Для прямого доказательства успешности агробактериальной трансформации клеток морских беспозвоночных мы определяли присутствие генов агробактерий в геноме морских беспозвоночных при помощи геноспецифической полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Рис. 5).

Рис. 5. Присутствие онкогенов rolB и rolC в трансформированных эмбрионах морского ежа.

Продукты амплификации с плазмиды, содержащей растительные rol онкогены (A, B дорожка 1). Продукты амплификации с ДНК, выделенной из контрольных необработанных клеточных культур (A и Б дорожка 2 и 3) и эмбрионов, культивируемых c плазмидой, содержащей rolB (A дорожка 4), rolC (B дорожка 4) и тотальная ДНК из клеточных культур, обработанных агробактериями, содержащими ген rolB (A дорожка 5), rolC (B дорожка 5). М- синтетический маркер.

Таким образом, была экспериментально доказана возможность переноса генетического материала от почвенных бактерий к морским беспозвоночным, что дает возможность по новому взглянуть на возможные пути филогенетического развития морских беспозвоночных. Более того, значительно возрастала пролиферативная активность эмбриональных клеток морских ежей, обработанных агробактериями с онкогеном rolB, в сравнении с контрольными клетками. Данные результаты указывают на сходство процессов неопластической трансформации у растений и животных.

Источник: Дячук В.А.(1), Одинцова Н.А.(2), Киселев К.В.(1,3), Яковлев К.В.(1), Булгаков В.П.(3)

• Дальневосточный государственный университет, Владивосток, Россия
• Институт биологии моря ДВО РАН, Владивосток, Россия
• Биолого-почвенный институт ДВО РАН, Владивосток, Россия

© Энерголам плюс

Понравилась статья? Поделиться с друзьями:
Энерголам плюс
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: